摘要
以γ-苄基-L-谷氨酸（Bz-Glu）为原料，经三光气环化制备γ-苄基-L-谷氨酸N-羧基酸酐（Glu-NCA）；通过0℃开环聚合合成端基高活性线性聚γ-苄基-L-谷氨酸（PBG）；利用HBr/TFA选择性脱保护引入可控羧基位点；采用DIC/HOBt肽偶联体系，经“脱保护–接枝”循环，构建G0～G3代单分散树枝状PBG。结果表明：低温聚合显著抑制链端环化，伯胺端基保留率>98%；DMSO替代DMF可消除α-螺旋位阻，G1代接枝率提升至53%；G3代分子量达1.1×10⁶，分子量分布指数≤1.06；溶剂可诱导α-螺旋–无规线团可逆转变，DMF中流体力学直径24.5 nm，DMSO中34.5 nm。该树枝状多肽兼具高单分散性、生物相容性与构象可调性，为药物递送与蛋白模拟提供理想平台。
关键词：聚谷氨酸；树枝状多肽；开环聚合；可控脱保护；构象调控；单分散性
1 引言
聚谷氨酸（PGA）是一类由谷氨酸单体通过酰胺键连接形成的生物可降解、低免疫原性多肽，在药物载体、组织工程、纳米递送系统等领域具有重要应用价值。根据连接方式，PGA分为α-聚谷氨酸与γ-聚谷氨酸：γ-PGA多由微生物发酵制备，而α-PGA及拓扑结构可控的衍生物（梳形、星形、树枝状）需通过化学合成实现。
树枝状多肽（Arborescent Polypeptides）兼具树枝状聚合物的精确支化结构与多肽的生物相容性，可模拟球状蛋白的空间构象，同时具备单分散性、内部空腔与可修饰表面，是理想的药物载体与蛋白模型。目前树枝状多肽合成主要采用“从表面生长（grafting from）”法，但易导致分子量分布宽（Mw/Mn>1.3）、结构缺陷多。
本文采用“接枝到表面（grafting onto）”策略，以Glu-NCA为单体，经低温开环聚合、可控脱保护、逐步接枝，合成G0～G3代树枝状PBG。系统研究聚合温度、脱保护度、溶剂效应与偶联条件对产物结构与性能的影响，阐明溶剂诱导构象转变机制，为高性能生物医用多肽材料开发提供新路径。
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
γ-苄基-L-谷氨酸（Bachem，99%）、三光气（Aldrich，98%）、正己胺、N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt）、三氟乙酸（TFA）、HBr/乙酸溶液（33%）、无水DMF、无水DMSO、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙醚均为分析纯或超干溶剂，直接使用或经CaH₂减压蒸馏纯化。
Bruker 300 MHz/500 MHz核磁共振仪、Waters SEC-MALLS系统、Brookhaven BI-200 SM动态光散射仪、真空干燥箱、低温反应浴、氮气保护装置。
2.2 γ-苄基-L-谷氨酸N-羧基酸酐（Glu-NCA）的合成
将10.0 g（42.0 mmol）Bz-Glu悬浮于300 mL无水乙酸乙酯，氮气保护下加热至回流；缓慢加入4.8 g（16 mmol）三光气，回流3 h；冰水浴冷却1 h，依次用冰水、0.5% NaHCO₃水溶液快速洗涤；有机相经无水MgSO₄干燥、过滤、减压浓缩至100 mL；加入等体积冷正己烷，-20℃结晶过夜；氮气保护下过滤，真空干燥得白色晶体Glu-NCA，产率92%。
2.3 线性聚γ-苄基-L-谷氨酸（PBG）的开环聚合
将8.00 g（30.4 mmol）Glu-NCA溶于20 mL无水DMF，0℃搅拌溶解；加入200 μL（1.52 mmol）正己胺（单体/引发剂=20），0℃密封反应72 h；反应液倒入甲醇沉淀，过滤、甲醇多次洗涤；真空干燥得白色粉末线性PBG，产率80%。
2.4 线性PBG的选择性部分脱保护
将1.46 g线性PBG（聚合度51）溶于15 mL TFA，加入0.35 mL 33% HBr/乙酸溶液，室温搅拌3 h；反应液倒入乙醚沉淀，过滤得橙色固体；经THF/少量DMF重溶、乙醚再沉淀纯化，真空干燥得白色脱保护PBG-COOH，脱保护率31 mol%。
2.5 G0～G3代树枝状PBG的合成
G0代合成：0.141 g PBG-COOH（0.220 mmol -COOH）与1.10 g线性PBG（过量25%）溶于6 mL无水DMF；加入1.72 mL 10% DIC/DMF、0.149 g HOBt、0.8 mL三乙胺，室温反应24 h；加入0.50 mL正己胺淬灭活性酯，甲醇沉淀、过滤；制备级SEC纯化，真空干燥得G0-PBG。
G1～G3代合成：G0-PBG经0.3 eq HBr/TFA脱保护（脱保护率32 mol%），与线性PBG在无水DMSO中偶联24 h，SEC纯化得G1-PBG；重复“脱保护–接枝”循环，依次合成G2、G3-PBG。
2.6 结构表征
¹H NMR：CDCl₃或d₆-DMSO为溶剂，测定聚合度、脱保护率与构象；¹⁹F NMR：三氟苯甲醛衍生化，定量端基伯胺含量；SEC-MALLS：N,N-二甲基乙酰胺为流动相，测定绝对分子量与分布；DLS：25℃，90°散射角，测定流体力学直径；酸碱滴定：验证羧基含量。
3 结果与讨论
3.1 Glu-NCA单体制备
三光气与Bz-Glu在无水回流条件下发生环化反应，生成Glu-NCA。¹H NMR显示特征峰与结构完全匹配，单体纯度>95%。全程无水无氧可避免NCA水解，保证后续聚合可控性。
3.2 线性PBG的低温开环聚合
NCA开环聚合中，伯胺引发剂进攻羰基，开环释放CO₂并形成酰胺键。0℃低温显著抑制链端环化副反应：室温聚合时伯胺端基保留率仅70%，而0℃聚合可达98%。¹H NMR计算聚合度为26，SEC显示Mw/Mn=1.10，分子量分布窄，为接枝反应提供高活性底物。端基稳定性测试表明：5℃氮气储存4周，伯胺保留率维持90%，室温储存降至78%，提示线性PBG需低温避光保存。
3.3 线性PBG的可控脱保护
HBr/TFA选择性断裂γ-苄基酯，主链酰胺键稳定。通过调控HBr/苄基酯摩尔比（0.25～0.30:1），可精准控制脱保护率在30%～40%。
图1 线性PBG脱保护前后¹H NMR谱图
（a）脱保护前；（b）脱保护后；峰1：苄基亚甲基质子；峰2：主链次甲基质子
¹H NMR中，4.9～5.0 ppm苄基质子积分降低，3.7～4.4 ppm主链次甲基积分不变，计算得脱保护率31%，与滴定结果一致。脱保护前后SEC曲线重合，Mw/Mn≈1.04，无明显链降解，脱保护选择性优异。
3.4 G0代合成与SEC表征
图2 G0代粗产物SEC流出曲线
（左峰：G0接枝聚合物；右峰：未反应线性PBG）
G0代在DMF中合成，接枝率62%，偶联效率41%，Mw/Mn=1.04。
3.5 树枝状PBG的逐级构建与溶剂效应
高代合成时，溶剂效应显著：DMF中PBG呈刚性α-螺旋，空间位阻大；DMSO破坏分子内氢键，PBG转为无规线团，活性位点充分暴露，显著提升接枝效率。G0～G3代结构参数如表1所示：G3代分子量达1.1×10⁶，Mw/Mn≤1.06，单分散性远优于“grafting from”法。随代数增加，支化度由6.6增至165，但G2→G3支化度增幅放缓（仅2.3倍），归因于分子内部空间拥挤，活性位点被屏蔽，扩散受限成为高代增长的主要瓶颈。
表1 G0～G3代树枝状PBG结构参数
| 代数 | Mₙ（MALLS） | Mw/Mn | 接枝率 | 偶联效率 | 支化度fₙ |
|---|---|---|---|---|---|
| G0 | 5.3×10⁴ | 1.04 | 62% | 41% | 6.6 |
| G1 | 1.3×10⁵ | 1.06 | 38% | 30% | 21 |
| G2 | 4.9×10⁵ | 1.03 | 46% | 50% | 96 |
| G3 | 1.1×10⁶ | 1.03 | 32% | 21% | 165 |
3.6 溶剂诱导构象转变
图4 G0与G3代PBG在DMF与DMSO中的¹H NMR谱图（次甲基区域）
（a、c：DMF中α-螺旋；b、d：DMSO中无规线团）
¹H NMR显示：DMF中PBG主链次甲基峰尖锐高场，呈α-螺旋构象；DMSO中峰宽化低场位移，转为无规线团。该转变在高度支化的G3代中仍可实现，表明拓扑结构不影响主链构象可调性。
3.7 端基活性验证
图5 线性PBG端基¹⁹F NMR分析
（a）反应前活性端基；（b）反应后未反应侧链端基）
¹⁹F NMR证实低温合成的线性PBG端基伯胺保留率>98%，接枝后未反应链端活性显著下降，空间位阻是接枝效率受限的主因。
3.8 流体力学尺寸分析
DLS测定流体力学直径：DMF中G3代为24.5 nm（螺旋紧凑），DMSO中为34.5 nm（线团舒展），粒径10～35 nm，符合体内长循环要求。
4 结论
本文通过低温开环聚合、可控脱保护、DMSO辅助逐步接枝，成功合成G0～G3代单分散树枝状PBG。低温聚合抑制副反应，保证端基高活性；可控脱保护精准引入接枝位点；DMSO消除α-螺旋位阻，实现高代高效接枝。G3代分子量达1.1×10⁶，Mw/Mn≤1.06，兼具高单分散性与溶剂响应构象转变特性。该树枝状多肽为药物递送、蛋白模拟与生物医用材料开发提供了重要技术支撑，具有广阔应用前景。
参考文献
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